Реферат: Исследование некоторых физико-химических свойств протеиназы Penicillium wortmannii
Ферментативная реакция в целом состоит, по крайней мере, из трёх последовательных стадий: образование фермент-субстратного комплекса, превращение этого комплекса в комплекс фермент-продукт и диссоциация промежуточного продукта. Влияние температуры на реакцию в целом является результатом её влияния на каждую из этих стадий.
Известно много ферментов, для которых естественные условия их действия не совпадают с оптимальными параметрами рН и температуры. Таким образом, внешние факторы позволяют с достаточным эффектом регулировать интересующие процессы, особенно при технологической обработке биологических объектов, например мяса и мясных продуктов.
Специфичность ферментов объясняется в первую очередь совпадением пространственных конфигураций субстрата и субстратного центра фермента. По-видимому, только тогда, когда совпадение это достаточно полно, может образоваться фермент-субстратный комплекс и, следовательно, начаться процесс ферментативного катализа. Детальное изучение специфичности ферментов показало, что пределы её у разных ферментов различны. Одни ферменты обладают абсолютной специфичностью, т.е. каталитически ускоряют одну – единственную реакцию. Примером такого фермента может служить уреаза. Другие ферменты осуществляют катализ реакций определённого типа независимо от того, какие конкретные вещества в них взаимодействуют или распадаются. Основным признаком для ферментов этого типа является характер связи. Такие ферменты характеризуются, следовательно, групповой специфичностью. Наконец, некоторые ферменты отличаются стереохимической специфичностью, т.е. действуют только на один из пространственных изомеров. Примером могут служить ферменты, расщепляющие a- и b-метилглюкозиды.
Катализируемая химическая реакция представляет тот специфический признак, по которому один фермент отличается от другого. Современная классификация основана на этом признаке. Ферменты делят на группы в зависимости от типа катализируемой реакции и на подгруппы, более точно характеризующие эту реакцию.
Часто на практике протеолитические ферменты, известные и тем более мало изученные, подразделяются на группы в зависимости от оптимального значения рН действия на субстраты. Как правило, выделяют три группы:
1. Щелочные протеиназы, стабильные и активно действующие в области рН 5 – 10. Максимальная их активность обнаруживается при рН 9,5 – 10,5. Установлено, что это главным образом сериновые протеиназы (для акта катализа важную роль играют функциональные группы серина); они активно ингибируются диизопропилфторфосфатом (ДФФ).
2.Нейтральные протеиназы с оптимумом рН для протеолиза около 7,0. В эту группу объединяют большинство металлоферментов, чувствительных к таким аддентам, как ЭДТА и о-фенантролин. Они не ингибируются ДФФ и тиоловыми реагентами, устойчивы при рН 6 – 9.
3.Кислые протеиназы, активные при рН 2 – 5, не чувствительные к сульфгидрильным реагентам, металлохелатным агентам, тяжёлым металлам и к ДФФ. Для акта катализа этой группы ферментов важны остатки карбоксильных групп глутаминовой и аспарагиновой кислот.
Вместе с тем отметим, что зависимость активность – рН носит подчинительный характер и связана со структурой активного центра,
определяющего механизм действия.
1.3 . Выделение и очистка препаратов протеиназы.
Современный уровень науки и техники позволяет получить не только комплексные, но и гомогенные, кристаллические ферменты. Их, как правило, выделяют непосредственно из биомассы гриба или культуральной жидкости, а так же из экстрактов поверхностных культур.
В качестве осадителей при получении комплекса препаратов протеиназ применяют сульфат аммония [14, 17], этанол [17], ацетон, изопропанол [24].
Отмечается, что в зависимости от применяемого осадителя выход фермента бывает различным. Так при использовании различных органических растворителей в концентрации 80% , выход протеолитических ферментов составил: 56% - для этанола, 78% - изопропанола, 65% - ацетона.
Вместе с тем, сочетание различных осадителей приводит к более полному отделению от сопутствующих веществ. К. А. Калунянц с соавторами [13] для очистки препарата реннинопузилин П10х воспользовались осаждением сульфатом аммония. Полученный осадок растворяли в воде, фракционировали этиловым спиртом. При этом авторам удалось отделить значительную часть сопутствующих белков.
Таким способом получают комплексные ферментные препараты. Их можно применять в народном хозяйстве, не проводя дальнейших этапов очистки. Более полная очистка возможна с помощью таких методов разделения как гельфильтрации на сефадексе, хроматографии на ДЭАЭ-сефадексе, КМ-сефадексе, КМ-целлюлозе, ДЭАЭ-целлюлозе.
Например, протеиназа Torula thermofila была выделена и очищена в 11 раз в результате диализа препарата, полученного осаждением сульфатом аммония, с последующей гельфильтрацией на сефадексе У-100.
Для разделения коллагеназы и нейтральной протеиназы Achromobacter iophagus препарат, полученный осаждением сульфатом аммония, подвергли диализу, а так же хроматографии на ДЕ-32 целлюлозе.
Наиболее изученные протеолитические ферменты, продуцируемые Bac. Subtilis, получены в кристаллическом состоянии. Схема очистки этих препаратов включает: высаливание сульфатом аммония 75% насыщения с последующим диализом против ацетатного буфера. Затем двух кратное осаждение 67% ацетоном и диализ против трисбуфера с последующей хроматографией на ДЕАЕ-сефадексе А-50 [30].
При разделении нейтральной и щелочной протеиназ Asp. Oryzae ОИТ-5038 использовали осаждение сульфатом аммония 80% насыщения, с последующей хроматографией на ДЕАЕ-целлюлозе и сефадексе У-100.
Для отделения баластных белков и пигментов от протеиназы Asp. Terricola Войнарским разработан метод очистки на биогеле Р-10. В результате активность протеиназы возросла в 30 раз, а содержание пигментов уменьшилось в 100 раз.
В результате ионообменной хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе был получен препарат нейтральной протеиназы Streptomyces acidoresistous 1403 с десятикратной степенью очистки.
Наиболее эффективным методом выделения и очистки ферментов является афинная хроматография. Метод основан на использовании взаимодействий, аналогичных взаимодействию фермента с субстратом. Как правило, ферменты, полученные с помощью афинной хроматографии, являются гомогенными или смесью изоферментов. Это подтверждается данными электрофокусирования, электрофореза в полиакриламидном геле, определением аминокислотной последовательности [20].
В настоящее время достаточно широко применяется для очистки метод ультрафильтрации растворов ферментов. Преимуществом ультрафильтрации являются отсутствие тепловой инактивации и небольшие энергозатраты. Ультрафильтрация позволяет провести концентрирование раствора без фазового превращения при комнатной температуре, при одновременном освобождении от баластных веществ (пигментов, низкомолекулярных соединений). Например, Рожанская с соавторами [27] с успехом использовали метод ультрафильтрации при очистке протеиназ из Asp. terricola и Streptomyces sp.
Приведённые литературные данные, касающиеся вопросов выделения и очистки протеолитических ферментов, свидетельствуют о том, что сочетание различных методов позволяет получить гомогенные ферментные препараты из культур микроорганизмов. Применение того или иного из них зависит от индивидуальных свойств фермента, конечной цели при его применении, физико-химических факторов.
Анализируя литературные данные, мы пришли к выводу, что молекулярная масса нейтральных протеиназ находится в интервале 20000 – 50000. Все они имеют довольно высокий температурный оптимум, лежащий в интервале 40 – 60oС, оптимальное значение рН 7,0 – 8,0, диапазон стабильности характеризуется значениями рН 5,0 – 10,0. Так нейтральная протеиназа Bac. Subtilis имеет оптимум рН 7,0 и температурный оптимум 52oС. Протеолитические ферменты Bac. Subtilis, выделенные А.А. Глемжай и сотрудниками, имеют несколько оптимумов рН (от 6,5 до 10,5). Молекулярная масса нейтральной протеиназы 38000 – 45000, щелочной – 27000 – 29000.
Препараты протеиназ Pseudomonas aeruginosa 700/75 имеют рН оптимум от 7,5 до 10,0. Протеиназы различных фракций обладали различными рН оптимумами. Фермент с молекулярной массой 28000 имеет оптимум рН 10,5. Уменьшение молекулярной массы коррелировало со снижением оптимума рН. Так, протеиназа с молекулярным весом 20000 характеризуется рН оптимумом 7,0.
Известны термостабильные препараты протеиназ. Для термостабильного фермента, выделенного из Thermoactinomyces thalpophilus максимальная активность обнаружена при рН 6,0 и сохранялась до 70% при изменении рН от 5,0 до 8,0. Оптимальная температура равна 70oС, но через 30 минут выдерживания при 70oС сохраняется лишь 62% активности [32].
Другая термостабильная нейтральная протеиназа – прототерпин имеет оптимум температуры 79oC, за 60 часов инкубации при 60oС потеря активности не превышает 15%.
Итак, рН оптимум для нейтральных протеиназ варьирует от 6,0 до 8,0, температурный оптимум 40 – 60oС, однако термостабильность ферментов может варьировать в широком диапазоне.
1.4 Расщепление коллагенсодержащего сырья и его применение.
Перспективное направление обработки коллагенсодержащего сырья – его ферментация. Авторами обзора [5] показано, что употребляемые для улучшения качества мяса ферментные препараты должны иметь следующие свойства:
- вызывать изменение соединительной ткани;
- слабо действовать на мышечную ткань;
- иметь возможно более высокий температурный оптимум действия, сохраняя способность частично изменять ткани при тепловой обработке;
- действовать в слабокислой или нейтральной среде с максимальной активностью;
Страницы: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11
