Реферат: Литература - Другое (книга по генетике)
p>прикрепившиеся
и не давшие
роста клетки,
соскребы с
цитоге-нетических препаратов и, что особенно удивительно, получен-
ные при паталогоанатомическом анализе и длительно хранивши-
еся фиксированные ткани (Higuchi, R. et al., 1988). Более
подробные сведения о постановке ПЦР можно получить в ряде
специальных руководств и инструкций.
Существуют различные модификации ПЦР, которые исполь-
зуются в зависимости от конкретных целей проведения реакции
или от характера последующего молекулярного анализа амплифи-
катов. Так, для трудноамплифицируемых участков ДНК (содержа-
щих различные повторяющиеся последовательности или необычные
структурные элементы), а также в тех случаях, когда матрич-
ная ДНК присутствует в следовых количествах, ПЦР проводят в
два раунда, используя в качестве матричной ДНК на втором
этапе амплификации, или как еще говарят при доамплификации,
продукты ПЦР, синтезированные в первом раунде. Часто в этих
случаях для повышения специфичности праймирования используют
систему, так называемых вмонтированных (nested) праймеров,
то есть при доамплификации в качестве праймеров выбирают
последовательности, локализованные внутри амплифицируемого в
первом раунде участка ДНК.
В ряде случаев удобно проводить мультиплексную ПЦР,
то есть одновременную амплификацию нескольких участков мат-
ричной ДНК. Можно получать меченые продукты ПЦР, добавляя в
реакционную смесь меченые трифосфаты. Особого внимания зас-
луживает возможность проведения ПЦР с молекулами кДНК.
На основе этой реакции разработаны методы анализа экспрессии
генов и получения больших количеств кДНК. Уместно заметить,
что реакцию амплификации можно проводить не только в раство-
рах, но и непосредственно на хромосомных препаратах, при
этом в случае использования меченых нуклеотидов продукты
амплификации будут гибридизоваться и выявлять комплементар-
ные им участки ДНК на хромосомах (метод PRINS - polymerase
reaction in situ). До настоящего времени доступными амплифи-
кации были участки ДНК, не превышающие по длине 5 kb. В
последнее время, благодаря внесению ряда кардинальных усо-
вершенствований (особый подбор праймеров, использование сра-
зу двух различных ДНК полимераз, трицинового буфера, специ-
ального температурного режима полимеразных циклов), возможно
проведение амплификации фрагментов ДНК, достигающих 35 kb. В
частности, таким образом удалось амплифицировать плазмиду со
вставкой 8.5 kb, равной целому геному вируса HIV 1 (Cheng et
al., 1994). И это еще не предел. В дальнейшем мы неоднократ-
но будем возвращаться к описанию различных модификаций ПЦР,
так как этот метод по праву стал один из основных в молеку-
лярной диагностике наследственных болезней ( Erlich, 1993;
Rolfs et al., 1993; RT-PCR, Methods and Applications, 1991).
Возможность очень точного и специфичного выбора участ-
ка ДНК для амплификации, небольшие размеры синтезируемых мо-
лекул, их огромное количество черезвычайно облегчают молеку-
лярный анализ продуктов ПЦР. Как правило, амплифицированную
ДНК можно непосредственно наблюдать в проходящем ултрофиоле-
те в виде красной полосы после электрофоретического концент-
рирования и обычного окрашивания геля этидиумом бромидом.
Кроме того, возможна идентификация этих молекул путем блот
гибридизации со специфическими олигонуклеотидными зондами.
При наличии сайтов рестрикции в амплифицированных участках
ДНК после их обработки эндонуклеазами и электрофореза коли-
чество и положение окрашенных полос на геле изменяется в
соответствии с положением этих сайтов (Рис. 1.11 ). Путем
электрофореза могут быть выявлены небольшие отклонения в
размерах синтезированных молекул, которые возникают за счет
делеций или инсерций нескольких нуклеотидов в исходной мат-
ричной молекуле ДНК; конформационные изменения в однонитевых
молекулах ДНК, возникающие при замене оснований; а также
структурные изменения в дуплексах между нормальными и му-
тантными вариантами амплифицированных фрагментов ДНК. И, на-
конец, возможно определение полной нуклеотидной последова-
тельности синтезированных молекул с идентификацией всех му-
таций в исследуемом районе матричной ДНК (см. Главу IV).
Разработаны варианты ПЦР, при которых синтезируются преиму-
щественно однонитевые фрагменты ДНК, что в последуюшем зна-
чительно облегчает их секвенирование. В дальнейшем мы более
подробно рассмотрим методы генотипирования мутаций с помощью
ПЦР, позволяющие производить полный молекулярный анализ
определенных участков ДНК у отдельных индивидуумов. При этом
отпадает необходимость визуализации малых количеств ДНК пу-
тем их гибридизации с мечеными геномными или кДНК-зондами.
Это не означает, конечно, что методы блот гибридизации и
клонирования потеряли свою актуальность. Без их использова-
ния невозможна молекулярная идентификация генов, предшеству-
ющая разработке методов молекулярной диагностики с использо-
ванием ПЦР.
ГЛАВА VI.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ.
Раздел 6.1 Дифференциальная активность генов, выбор
адекватных биологических моделей.
Молекулярная идентификация гена, нарушение работы кото-
рого приводит к развитию наследственного заболевания, созда-
ет предпосылки для дальнейшего более подробного анализа ге-
нетических и биохимических основ патогенеза и разработки на
этой базе наиболее эффективных методов лечения. Начальные
этапы решения поставленной задачи включают в себя иссследо-
вание механизмов тканеспецифической экспрессии и регуляции
активности генов в нормальных клетках, оценку клинического
выражения различных типов нарушений гена, выявление первич-
ного биохимического дефекта, а также сопоставление молеку-
лярных основ работы генов в нормальных и мутантных клетках.
Естественно, что в различных тканях организма
экспрессируется не все, а лишь определенные группы генов.
Исключение составляют лишь так называемые гены домашнего хо-
зяйства (house-keeping genes), генопродукты которых обеспе-
чивают жизнедеятельность всех типов клеток (см.Главу II). По
весьма ориентировочным оценкам в тканях млекопитающих и че-
ловека работают в среднем около 2-3% всех генов, в клетках
печени - основной биохимической лаборатории организма - око-
ло 5%, тогда как в клетках мозга - примерно 9-10% (Корочкин,
1977). Это означает, что в различных соматических клетках
эукариот транскрибируется от 5 до 20 тысяч генов (Льюин,
1987). Значительная часть контролируемых ими белков необхо-
дима для обеспечения жизнедеятельности самих клеток. В про-
цессе онтогенеза и клеточной дифференцировки в разных тканях
организма происходит избирательная активация многих других
специфических генов, что, в конечном итоге, обусловливает
значительные межклеточные различия в наборе белков и в ско-
рости их синтеза.
Контроль генной активности осуществляется за счет диф-
ференциальной транскрипции и процессинга РНК в клеточных яд-
рах, различной стабильности мРНК в цитоплазме, избирательной
трансляции мРНК. Дифференциальная экспрессия генов, конечным
результатом которой является синтез функционально активного
белка, предполагает не только адекватную регуляцию генной
активности, но и полноценность всех последующих этапов,
включая сам белковый продукт, его устойчивость, способность
к посттрансляционным модификациям, правильную локализации и
корректное взаимодействие с другими компонентами клетки. Ре-
шающее значение для успешного анализа всего этого сложного
комплекса имеет выбор адекватных биологических моделей, по-
иск и целенаправленное конструирование которых представляет
вполне самостоятельную научную задачу.
Наиболее доступными модельными системами для анализа
экспрессии генов in vitro являются культуры клеток. Для кло-
нирования, генноинженерного манипулирования, направленного
введения сайт специфических мутаций, получения большого ко-
личества клонированных последовательностей ДНК, специфи-
ческих молекул мРНК, а также белкового продукта гена обычно
используют генетически хорошо изученные прокариотические
системы (Хеймс, Хиггинс, 1987). Для исследования процессов
трансляции, посттрансляционных модификаций белка, его внут-
риклеточной локализации и функционирования чаще используют
культуры клеток эукариот и, в частности, специфические куль-
туры клеток человека. Особая роль в изучении начальных эта-
пов развития патологического процесса, обусловленного
присутствием генных мутаций, а также в разработке терапевти-
ческих методов, включая генноинженерную коррекцию метаболи-
ческого дефекта, принадлежит культурам мутантных клеток. Это
могут быть первичные или перевиваемые культуры клеток, полу-
ченные из специфических тканей больного человека, либо выде-
Страницы: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70
